操作步驟：
貼壁細胞
1、被檢細胞接種于無菌的 6 孔細胞培養板中，接種密度為 1-2×10 4 。同時，接種正常無支原體感染的同種細胞，作為陰性對照。
2、5 天后，先吸去培養液，再加入 1ml 的固定液，靜置 20min，
3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細胞），37℃避光放置 15-20min 或室溫靜置 20～30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液，加入 2ml 滅菌超純水洗滌三次，直接風干。風干后加入一滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。
6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發光激發，觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。

懸浮細胞：
1、收集需檢測的細胞，1500rpm，5min。
2、將收集的細胞涂片于載玻片上，再加 1ml 的固定液，靜置 20min。
3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細胞），37℃避光放置 15～20min 或室溫靜置 20～30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液，用無菌水洗滌玻片 3 次，直接風干。風干后加入一滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。
6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發光激發，觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。
結果判斷（參考）：
陰性：僅見細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。
陽性：除細胞外，細胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。
 
注意事項：
1．Hoechst 工作液對人體有害，請注意防護。
2．固定液有刺激性氣味，建議在通風櫥進行固定。
3．支原體檢測時，最好用不含抗生素的培養液培養 2～3 代，這樣容易避免假陰性結果。
4．本試劑盒用于 6 孔板檢測時，可以進行 50 次檢測反應。
5． 檢測支原體污染， 可以使用支原體高效 Vero 細胞， 這樣可以提高檢測靈敏度， 即將被檢測樣品接種于 Vero細胞進行檢測。

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